III)    Crescimento e morte de células bacterianas :

      Bactérias se reproduzem por fissão binária / bipartição / cissiparidade na qual uma célula parenteral origina duas células filhas                 crescimento exponencial (crescimento logarítimica).

      Tempo de duplicação : Ex - 20 min para e.coli e 24 h Mycobacterium tuberculosis. O tempo de duplicação varia com a espécie, quantidade de nutientes, temperatura, PH e outros fatores ambientais.

      Contagem do número total de bactérias : placa de Petroff = câmara de contagem           n° de bactérias/ml ou mm3. Também uas-se contadores eletrônicos que contam n° de bactérias/ml através da captação de sua movimentação.

      Contagem do n de bactérias viáveis : mais usada. Usa-se para fazer soro, vacinas, exames, em alimentação. Técnica mais utilizada : diluição em placas          diluições sucessivas da suspensão - mãe            coloca-se em estufas             cada bactéria vai produzir uma colônia                conta-se n° de colônias diluídas e compara com suspensão - mãe.

      Alças calibradas : para exame de urina / alça com volume conhecido, espalha em placa, conta n° de colônias no dia seguinte

      Técnicas para grande volume e pequeno n° de bactérias :

• filtração / membranas filtrantes : sistema fechado; bactérias ficam retidas no filtro e serão colocadas no meio de cultura para posterior contagem de bactérias vivas por quantidade total de água que passou pelo filtro.

• Número mais provável : NMP              para contagem de poucas bactérias. Série de 3 ou 5 tubos contendo mesmo volume com um indicador de crescimento . . . depois conta em quantos tubos houve crescimento e compara-se com tabela de NMP. Usado em controles da população bacteriana de alimentos, cosméticos, etc ...

       curva de crescimento bacteriano : ciclo apresenta 4 fases principais

log do n°

bact.

 3   1 : fase lag ou de espera

 2 : fase exponencial

 3 : fase estacionária

     4 : fase de degradação

                                           tempo

 1: metabolismo altíssimo, mas sem divisão celular. Duração depende do meio de cultura.

2:  rápida divisão celular, bactéria vai crescer em PG. É uma reta cuja inclinação vai depender da velocidade de divisão das bactérias. (penicilina atua nessa fase, pois há produção de peptideoglicana).

3:  ocorre quando há carência de nutrientes. Número de mortes se iguala ao número de células novas produzidas, resultando em uma situação de equilíbrio na população.

4: declínio no n° de células viáveis. Número de catabólitos aumenta até provocar morte de todas células.

 Nota : Quimiostato - aparelho no qual nutrientes estão sendo acrescidos e os produtos da degradação removidos. Assim, células podem permanecer na fase exponencial e não entrar na fase estacionária.

              Morte : perda irreversível da capacidade de reprodução. Avaliação da morte = usa-se um agente bactericida.

 I)              Ação de agentes físicos sobre os microrganismos :

1)  Conceitos :

      Desinfetante : desinfecção = morte de muitos, mas não de todos os microrganismos. Os desinfetantes variam em relação à danificação dos tecidos : fenol - objetos inanimados / etanol e iodo - superfícies cut6aneas.

      Anti-séptico : subst6ancia química utilizada para matar microrganismos da superfície da pele e mucosas. Ex : mertiolate; PUP - Iodo (polevidine).

      Sanitização : técnicas de evitar comprometimento na saúde pública. Utilizado para utensílios públicos, lugares, ...

      Esterilização : eliminação de um determinado material de todos os microrganismos, inclusive os esporos de bactérias que são altamente resistentes. Normalmente utilizada por autoclavação : exposição ao vapor a 121°C por um período de 15 min. Soluções intravenosas esterelizadas por filtração e instrumentos cirúrgicos por exposição ao óxido de etileno (podem ser danificados por calor úmido).

      Agente bactericida /fungicida / vivicida = substâncias microbicidas : matam micróbios.

      Bacteriostáticos / virostáticos / fungistáticos = substâncias microstáticas, só param crescimento. (ex : maioria dos antibióticos ).

      Antibióticos = drogas produzidas por microrganismos (penicilina).

      Quimioterápicos : drogas de origem botânica ou sintética = sulfa.

      Quimioterápicos _ antibióticos = agentes antimicrobianos : têm toxidez seletiva maior que o desinfetante, mas ainda provocam inúmeros efeitos colaterais. Maioria são mcrostáticos, ou seja, agem em fases do metabolismo.

      Assepsia : aus6encia de micróbios / precisa de procedimentos trabalhosos / usam quase todas as substâncias anteriormente descritas (por último : antimicrobianos).

2)  Agentes físicos :

2.1) Calor úmido :

      Denatura proteína e funde lipídeo.

      É muito mais eficiente que o calor seco, é mais microbicida.

      Tem alto calor latente (demora para esquentar e esfriar - conserva melhor o calor)

      Alto poder de penetração e faz pontes de hidrogênio com proteína denaturada impedindo-a de voltar ao normal.

      O calor úmido utiliza temperaturas mais baixas que o seco.

      Técnicas utilizadas :

• fervura simples : esporos resistem à essa fervura. Mata maior parte das formas vegetativas dos micr;obios.
• Autoclavação : mata todos os micróbios / fervura a mais de 100°C/ aumenta-se a pressão e eleva-se a temperatura até 121°C por 30 min - mata tudo (EX :Clostridium botulinum - em formas de esporos resistem  de 3 a 5 h de fervura a 100°C. Produz toxina que inibe liberação de acetilcolina)
• Autoclave em material cirúrgico : não pode por em lata, pois terá calor seco em 121°C o que não é suficiente, deve-se embrulhar em um pano e depois guardar em um forno para manter o processo.
• Pasteurização : aquecimento a 62°C por 30 min, seguido por um resfriamento rápido. Pasteurização rápida - HTSH = 72°C por 15 segundos - não esteriliza o leite. VHT - 135-145°C por 1 a 2 seg e depois resfriamento em 5 seg em temperatura ambiente para manter propriedades organolépticas.

• Tindalização : Tindal achou forma de eliminar esporos só fervendo. Caldo com esporos eram fervidos durante 3 dias seguidos por 30 minutos. Mata formas vegetativas e esporos que passam a formas vegetativas. Usada para soluções que não suportam a temperatura do autoclave. Não há certeza de esterilização, só a autoclavação tem essa certeza.

2.2) Calor seco :

      Chama direta e forno e Pasteur

      Chama direta / flambagem : é usada para desprezar materiais descartáveis para não haver contaminação do ambiente (incineradores de hospitais)              é uma técnica muito limitada de esterilização.

      Forno de Pasteur : temperatura tem que ser maior que o autoclave, pois não há penetração da água / 170-180° 1,5 a 2 h para esterelizar material (são embrulhados em papéis resistentes) / material cirúrgico dentro de latas fechadas tem corte diminuído, existem técnicas que preservam mais a meia vida do instrumento.

Nota 1 : morte térmica - TRD (tempo de redução decimal) = morte de 90% da população em 10 min. Usado para esterelizar determinadas soluções.

Nota 2 : soluções injetáveis não podem Ter pirogênios endógenos.

 3)  Frio :

      Não é eficiente

      Não permite multiplicação das bactérias

      Alguns autores acham que submetidas ao frio lento formam-se cristais que perfurariam a membrana das bactérias.

      Congelamento rápido : técnica de liofilização - usada principalmente na preservação de vacinas.

• se usa nitrogênio líquido (-196°C)
• sublimação em auto-vácuo - fica somente o "esqueleto"da bactéria / quando for usar é só acrescentar mesmo volume de água que foi retirado.

Nota 1 : Bacilo cereus do arroz - causa intoxicação / arroz deve ser guardado na geladeira.

Nota 2 : toxiinfecção - ingere-se bactéria que dentro do organismo produzirá toxinas.

1)  Radiação :

      Existem 2 tipos  ultravioleta (A)

                              Ionizante (B)

      (A)

    melhor atividade antimicrobiana na faixa de 250-260nm

    não tem muito poder de penetração, é barrado pelo vidro.

É desinfetante.

Não é desinfetante, pois bactérias possuem técnicas de correção das mutações causadas.

Principal mecanismo de ação : sobre o DNA formando dímeros de timina adjacentes / quebra pontes de hidrogênio e promove ligações covalentes entre timinas adjacentes. Assim, a replicação de DNA é inibida fazendo com que o organismo não possa mais crescer.

Mecanismos de reparo : Fotorreativação - correção mais rápida, ocorre em presença de luz visível que ativa enzimas que realiza os cortes de todos os dímeros. Reativação no escuro - mais lento que a fotorreativação, mas tão eficiente quanto / usa 4 enzimas (1- corte, 2-ampliação do vão, 3-cópia do certo, 4- junta/liga pontas).

      (B)

Raio X (0,1 a 10 nm) e Raio gama (0,001 a 0,1 nm) : ordem de grandeza semelhantes.

Tem diferença na origem

Raio X : vem do bombardeamento de elemento (movimento dos elétrons entre as camadas liberam R-X).

Raio gama : emissão radioativa nuclear - vem da desintegração dos núcleos instáveis. Ioniza tudo que vê pela frente : "arranca"elértons. Ioniza a água que é 85% do bactéria. Tem ação instantânea ao contrário da ultravioleta. Dependendo da concentração é esterelizante. Os materiais que recebem Raio gama não retém radiação, pois ação é instantânea. Alimento tem 30% de redução do seu estrago.

2)  Vibrações sônicas : não é muito eficiente. Faz moléculas vibrarem podendo quebrá-las. Utilização : obtenção de pedaços de bactréias em pesquisas.

3)  Filtração :

      Tipos de filtro : porcelana porosa

                             Vidro sintetizado

                              Celulose (mais usado / filtro milliporo)

      Filtros HEPA (alta eficácia) : para manter ambientes livres de micróbios como salas de cirurgia e salas de computador (não pode ter poeira). É um filtro de celulose com várias dobras - não há turbilhonamento doar, este deve seguir um fluxo laminar. Se ocorrer turbilhonamento a poeira pode ser levantada.

 I)              Ação de agentes químicos sobre os microrganismos :

1) Mecanismos básicos de ação  denaturação de proteínas

                                            solubilização de lipídeos

2)

      Fenóis denaturam proteínas e causam danos á membrana.

      Hexaclorofeno : foi muito utilizado em pastas de dente, mas foi abandonado por ser cancerígeno.

      Cresol é um derivado do fenol : é o ingrediente ativo do Lisofórmio.

      Eugenol : desinfeta buraco de cárie / não é anti-séptico / se encostar na gengiva arde.

      Fenol é um padrão para seus derivados = coeficiente fenólico. Ex: mertiolate - CF = 0,5. Assim, tem metade da ação do fenol / é fraco.

1)  Oxidantes :

      Cloro : é um desinfetante largamente utilizado para purificar o abastecimento de água e para o tratamento de piscinas. O cloro em água dá hipoclorito (água sanitária) - usado com desinfetante em casas e hospitais. Oxigênio é mais eletronegativo que o cloro, por isso rouba elétrons deste formando água e cátion clorônio (potente oxidante). A concentração de cloro ativo que se deve usar é de 0,5% para ser eficiente. Mata através de ligações cruzadas nos grupamentos sulfidrílicos essenciais das enzimas formando pontes dissulfeto inativas.

      Gluconato de clorhexidina : anti-séptico usado para lavar as mãos no hospital.

      Iodo : também inativa as enzimas que contém pontes dissulfeto e se liga especificamente a resíduos de tirosina nas proteínas. É o melhor anti-séptico cutâneo utilizado. Tem duas formas : tintura de iodo (iodo a 2% mais KI em etanol- álcool iodado) = prepara pele antes da retirada de sangue / deve ser retirado com álcool ; DUP -I = polivinilpirolidona + iodo / é menos irritante / tem um pouco de ação detergente / preparar pele antes de uam cirurgia

      Hipoclorito de sódio (líquido) / hipoclorito de cálcio(sólido) - em piscinas (cloro gasoso tem aplicação complicada).

      Água oxigenada é boa em tecidos necrosados, pois hemácias possuem catalase liberando O2.

      Esterilização por plasma de H2O2 (solução aquosa de H2O2 à 50%) = é o mais moderno desinfetante de materiais (não é explosivo, mais barato, não resulta em resíduos tóxicos, aumenta durabilidade dos materiais, rapidez).

      Óxido de etileno : vai ser substituído pelo plasma. Tempo de duração : 20 a 36 h (à 55°C) contra 75 min do plasma.

2)  Alquilantes :

      Radical alquila (radicais orgânicos de cadeia aberta).

      Óxido de etileno quando utilizado em material anteriormente bombardeado por Raio gama formava cloridrinas cancerígenas - é um crime. Acrescenta radical alquila. Altamente explosivo, irritante e cancerígeno. Acaba com ptes de hidrogênio.

      Formol : substituição dos radicais -SH e -NH por CH3. Denatura proteína - quebra pte de H. Faz alquilação.

      B-propiolactona : acrescenta radical propila. Processo muito longo (20 a 36h).

      Glutaraldeído 2% : não é explosivo. Usado por oftalmologistas e em hospitais para esterelização de equipamentos de terapia respiratória. 10 min = desinfecção / 3-10h - esterelização. Muito mais eficaz que o formaldeído.

3)  Alcoóis :

      Principalmente desorganiza membrana lipídica, mas também denatura. Para sua atividade máxima requer presença de água (maior poder de penetração). O isopropílco é o melhor, mas é muito caro, por isso usa-se o etílico que não é tão eficiente, sendo então um potencializador de outras substâncias.

4)  Metais pesados :

      prevenção de infecção em queimaduras.

      Detergentes : agem principalmente nos lipídeos da membrana. Contém uma porção hidrofóbica e uma porção hidrofílica que pode ser um cátion ou um ânion. São surfactantes ativos. Cloreto de benzalcânio = usado no lugar do mertiolate ; é um etergente catiônico.

      Conservantes  de alimentos : tolerados por nós e diminuem a contaminação.

      Sal - em alta concentração é conservante / desidrata bactéria.

      Açúcar - cicatrização de feridas cirúrgicas (não é irritante e é fonte de energia para as células do local). Também desidrata.

I)              Genética e Variação Bacteriana :

1)  Introdução :

      Em colônias existem os monomorfistas = mesmas bactérias têm sempre as mesmas características, já que a reprodução é por divisão binária. Mas também existem algumas bactérias que apresentam características diferentes, isso pode acontecer através de 2 mecanismos  variação fenotípica

                                            variação genotípica

      Variação fenotípica :

• fenótipo - aquilo que se manifesta.
• Não ocorre alteração genética, as variações ocorrem em função do meio ambiente. Assim, cessado o estímulo, a bactéria volta a ser o que era antes.
• Exemplo 1 : produção de cápsulas por Klebsiella pneumoniae (bacilo GRAM - com cápsula) é cessada por falta de açúcar no meio, mas não param multiplicação.
• Exemplo 2 : raças de Corynibacterium dihteriae produzem toxinas o tempo todo, mas em presença de Fe 2+ há inibição.
• Exemplo 3 : Proteus spp são extremamente móveis (flagelos) o que dificulta o se isolamento e posterior estudo. Então, usa-se formol para inibir o crescimento de flagelo ou usa-se anticorpos contra os flagelos.

      Variação genotípica :

• não é reversível.
• Bactérias são haplóides, sendo o cromossomo bacteriano único e circular formado por dupla fita de DNA espalhado no citoplasma (sem carioteca).
• Normalmente duplicação de DNA é sincrônico com a divisão celular.
• Plasmídeos de DNA, podendo estar presentes ou não, dando novas características às bactérias que os possuem. Bem menores que os cromossomos. São capazes de se duplicar independentemente do cromosssoma bacteriano.
• Plasmídeo F : dá capacidade de fazer trocas genéticas por conjugação entre bactérias. Bactéria com plasmídeo F faz ponte citoplasmática (fimbria sexual) com outra bactéria e passa uma cópia do plasmídeo. Alguns se integram no cromossomo, mas é muito raro. Plasmídeo + cromossomo - há passagem somente de genes, pois a fimbria quebra logo.

• Plasmídeo R : (R= resistência) tem genes que promovem resistência a antimicrobianos. Age como o F.

• Plasmídeo bacteriocinogênio : produzem bactericinas que matam outras bactérias. Ex : S.coli - colicina ; Pseudomonas - piocinas. Mecanismo é para elas prevalecerem no ambiente.
• Transposons : pedaços lineares pequenos de DNA que se movem de um sítio para outro no DNA celular ou entre o DNA de bactérias, de plasmídeos e de bacteriófagos. São denominados de "genes saltadores". Não são capazes de se duplicar independentemente. Codificam enzimas relacionadas à resistência a drogas e podem causar mutações. Em sua terminação possuem sequências palindromicas.
• Prófago : são vírus temperados que infectam bactérias, mas que não causam sua lise (morte). Se inserem no cromossomo ou via plasmídeo. Se multiplica normalmente com a bactéria, mas para manter sua espécie ele de vez em quando entra em um ciclo lítico (ciclo lisogênico ).
• Mutação espontânea : se dá por tautomerização das bases do DNA. Tautomerização da timina da forma cetônica para a enólica (muda adenina para guanina = erro de replicação). Pode haver tautomerização induzida através e análogos de timina que causarão um maior enolização e maior porcentagem de erros na replicação. Pode ser ou não compatível com a vida.
• Transferência de material genético entre as bactérias : pode ocorrer de 3 formas - conjugação, transdução e transformação. Conjugação : cruzamento entre duas bactérias durante a qual o DNA é transferido da célula doadora para a receptora e é controlado pelo plasmídeo F que carrega os genes que codificam as proteínas necessárias à conjugação (mais importante - pilina = pilus sexual).
• Transformação : transferência do DNA por si de uma célula para outra. Raro in vivo. Pode ocorrer das seguintes formas : pode-se extrair DNA de um tipo de bactéria e introduzi-lo em uma bactéria geneticamente diferente ; ou uma bactéria que foi morta pode liberar seu conteúdo genético e este ser captado por outra bactéria. Ex :Streptococos pneumoniae - mistura das que não fazem cápsula com extrato das que fazem... resultado : as que não faziam passam a fazer.
• Transdução : um bacteriófago ao fazer sua cápsula no interior da bactéria pode juntar ao seu material genético pedaços do material genético da bactéria. Assim, quando for infectar outra bactéria trará para dentro dela material genético de outra célula bacteriana. É a transferência de DNA através de vírus bacterianos. Pode ser de dois tipos : generalizado (vírus carrega um segmento de qualquer região do cromossomo bacteriano) e especializado (maioria dos fagos temperados possuem sítios específicos de integração do DNA bacteriano. Assim, os genes celulares transduzidos são geralmente específicos para aquele vírus).
• Conversão fágica : DNA do fago dá capacidade da bactéria de produzir coisas. Ex : Clostridium botulinum (toxina botulínica), Corynebacterium diphteridae (toxina diftérica), Streptococos pyogenius (toxina eritrogênica).
• Pressão seletiva : uso indiscriminado de antibióticos causa uma enorme seleção. Em hospitais a seleção é gravíssima. Com a parada do uso prolongado de antibióticos, poderia-se selecionar as bactérias sensíveis por falta de uso dos genes de resistência, mas isso vai contra interesses econômicos das indústrias farmacêuticas.